CPTI Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419786-ACT

Il gene murino Cpt1a codifica la carnitina palmitoiltransferasi 1A (CPTI), l’enzima limitante della velocità che controlla l’importazione mitocondriale degli acidi grassi a catena lunga per la β-ossidazione attraverso la navetta della carnitina. Regolando la produzione di acetil-CoA e il flusso energetico, CPTI integra la disponibilità di nutrienti con la respirazione mitocondriale e influenza l’omeostasi lipidica, l’equilibrio redox e la segnalazione metabolica. L’attività di Cpt1a modella le risposte cellulari al digiuno e a condizioni ad alto contenuto di grassi e contribuisce al rimodellamento metabolico nei tessuti con elevata richiesta ossidativa. La disregolazione dell’ossidazione degli acidi grassi mediata da CPTI è stata associata, nei modelli murini, a fenotipi metabolici rilevanti per la sensibilità all’insulina, la gestione dei lipidi epatici e stati di attivazione infiammatoria.

CPTI Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cpt1a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CPTI Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cpt1a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cpt1a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CPTI. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cpt1a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CPTI nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CPTI nelle cellule tumorali con espressione di Cpt1a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.