Plásmido CRISPR de Activación (h) Cochlin: sc-405944-ACT

COCH codifica la coclina, una glicoproteína secretada de la matriz extracelular, enriquecida en los tejidos del oído interno, donde contribuye a la organización de la matriz, a la adhesión célula–matriz y a la homeostasis mecanosensorial. La coclina contiene dominios LCCL y dominios tipo factor A de von Willebrand que favorecen interacciones proteína–proteína y pueden influir en la proteólisis extracelular y en la señalización inflamatoria en microambientes locales. La expresión alterada de COCH o sus variantes se asocian con disfunción auditiva y vestibular hereditaria, lo que vincula la biología de la coclina con vías que gobiernan la remodelación de la matriz extracelular y las respuestas al estrés. Estas características hacen de COCH un modelo útil para estudiar cómo los componentes secretados de la matriz regulan la integridad tisular y la fisiología de los órganos sensoriales.

Cochlin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de COCH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cochlin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus COCH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional COCH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cochlin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo COCH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cochlin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cochlin en células tumorales con expresión de COCH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.