Cochlin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405944-ACT

COCH codifica la coclina, una glicoproteina secreta della matrice extracellulare arricchita nei tessuti dell’orecchio interno, dove contribuisce all’organizzazione della matrice, all’adesione cellula–matrice e all’omeostasi meccanosensoriale. La coclina contiene domini LCCL e domini simili al fattore di von Willebrand A che favoriscono interazioni proteina–proteina e possono influenzare la proteolisi extracellulare e la segnalazione infiammatoria nei microambienti locali. Un’alterata espressione di COCH o sue varianti sono associate a disfunzioni uditive e vestibolari ereditarie, collegando la biologia della coclina a vie che regolano il rimodellamento della matrice extracellulare e le risposte allo stress. Queste caratteristiche rendono COCH un modello utile per studiare come i componenti secreti della matrice regolino l’integrità tissutale e la fisiologia degli organi sensoriali.

Cochlin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COCH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cochlin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COCH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COCH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cochlin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COCH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cochlin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cochlin nelle cellule tumorali con espressione di COCH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.