CNT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404790-ACT

SLC28A1 codifica il trasportatore concentrativo di nucleosidi 1 (CNT1), un trasportatore di membrana plasmatica ad alta affinità e sodio-dipendente che media l’ingresso cellulare di nucleosidi pirimidinici come uridina e citidina. Controllando la via di recupero dei nucleosidi, CNT1 contribuisce all’omeostasi dei pool di nucleotidi necessaria per la sintesi di DNA/RNA, la progressione del ciclo cellulare e le risposte allo stress metabolico. L’attività di CNT1 si interseca con il metabolismo di purine e pirimidine e può influenzare la sensibilità a perturbazioni sperimentali basate su analoghi nucleosidici, modificando la disponibilità intracellulare dei substrati. Un’espressione disregolata di SLC28A1 è stata riportata in molteplici contesti patologici, incluso il riprogrammamento metabolico associato al cancro, rendendolo rilevante per studi sulla biologia dei trasportatori, sulla proliferazione e sui meccanismi di trasporto dei farmaci.

CNT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC28A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CNT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC28A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC28A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CNT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC28A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CNT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CNT1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC28A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.