CIS Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419665-ACT

Il gene murino *Cish* codifica la proteina CIS (cytokine-inducible SH2-containing protein), un membro della famiglia SOCS che funge da inibitore a feedback della segnalazione dei recettori delle citochine. CIS si lega ai complessi recettoriali fosforilati e ai motivi associati a JAK per attenuare l’attività a valle della via JAK/STAT e può promuovere il turnover dei componenti della segnalazione mediato dall’ubiquitina tramite interazioni dipendenti dal SOCS box. Attraverso questi meccanismi, CIS contribuisce a modulare l’attivazione delle cellule immunitarie, l’ematopoiesi e le risposte infiammatorie, limitando l’intensità e la durata dei programmi trascrizionali indotti dalle citochine. Un’attività deregolata di *Cish*/CIS è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi immunitaria e a fenotipi infiammatori, rendendolo un nodo utile per studiare l’attenuazione del segnale e il cross-talk tra le vie delle citochine.

CIS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cish senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CIS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cish nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cish, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CIS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cish nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CIS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CIS nelle cellule tumorali con espressione di Cish silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.