Cdc27 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400789-ACT

CDC27 codifica Cdc27, una subunità centrale del complesso promotore dell’anafase/ciclosoma (APC/C), una ligasi E3 dell’ubiquitina che guida la proteolisi ordinata di regolatori mitotici chiave per garantire una corretta segregazione dei cromosomi e le transizioni del ciclo cellulare. Attraverso l’ubiquitinazione dipendente da APC/C di substrati quali securina e cicline, Cdc27 contribuisce a coordinare la segnalazione del checkpoint del fuso, l’uscita dalla mitosi e il mantenimento della stabilità genomica. La deregolazione dei componenti dell’APC/C e del controllo dei checkpoint è associata all’instabilità cromosomica e a fenotipi proliferativi osservati in molteplici contesti tumorali, rendendo CDC27 un nodo utile per studiare il controllo mitotico e la dinamica del sistema ubiquitina–proteasoma. CDC27 umano è quindi ampiamente utilizzato nelle ricerche sulla tempistica della divisione cellulare, l’affidabilità dei checkpoint e le vie che collegano la proteostasi al mantenimento del genoma.

Cdc27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDC27 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdc27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDC27 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDC27, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdc27. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDC27 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdc27 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdc27 nelle cellule tumorali con espressione di CDC27 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.