Cdc25A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400345-ACT

CDC25A codifica Cdc25A, una fosfatasi a doppia specificità che attiva le chinasi ciclina-dipendenti rimuovendo fosfati inibitori, favorendo così la progressione G1/S e coordinando la replicazione del DNA con il controllo dei checkpoint. Cdc25A integra segnali provenienti dalle vie di risposta al danno al DNA, incluse ATM/ATR–CHK1/CHK2, che ne regolano stabilità e attività per limitare l’ingresso nel ciclo cellulare in condizioni di stress genotossico. Un’espressione o un turnover alterati di CDC25A possono compromettere la fedeltà dei checkpoint, aumentare lo stress replicativo e contribuire all’instabilità genomica osservata nei disordini proliferativi. Di conseguenza, CDC25A è ampiamente studiato nella regolazione del ciclo cellulare, nella tempistica di replicazione e nel rimodellamento delle reti di risposta allo stress nelle cellule umane.

Cdc25A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDC25A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdc25A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDC25A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDC25A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdc25A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDC25A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdc25A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdc25A nelle cellule tumorali con espressione di CDC25A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.