CD64 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420305-ACT

Il gene murino Fcgr1 codifica CD64 (FcγRI), un recettore ad alta affinità per le IgG espresso prevalentemente su monociti, macrofagi e cellule dendritiche, dove collega il riconoscimento dei complessi immuni alla fagocitosi, al burst ossidativo e alla produzione di citochine. CD64 segnala attraverso il motivo ITAM della catena γ dell’FcR per attivare le vie SYK, PI3K, MAPK e NF-κB, integrando l’attivazione dell’immunità innata con l’acquisizione e il processamento dell’antigene. In quanto regolatore delle funzioni effettrici anticorpo-dipendenti, Fcgr1 è ampiamente studiato in contesti infiammatori e autoimmuni, in modelli di infezione e nella biologia dei mieloidi associati al tumore, dove variazioni dell’espressione di CD64 possono riflettere stati di attivazione alterati e la differenziazione mieloide. Il suo ruolo nella gestione dei complessi immuni collega inoltre Fcgr1 al crosstalk con il complemento, all’endocitosi mediata da Fc e a programmi trascrizionali a valle che modellano l’infiammazione tissutale.

CD64 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fcgr1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD64 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fcgr1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fcgr1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD64. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fcgr1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD64 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD64 nelle cellule tumorali con espressione di Fcgr1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.