CD39L4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410720-ACT

L’ENTPD5 umano codifica CD39L4, un’ectonucleoside trifosfato difosfoidrolasi localizzata nel reticolo endoplasmatico che idrolizza UDP e GDP a monofosfati, sostenendo l’omeostasi degli zuccheri nucleotidici e il controllo di qualità delle glicoproteine. Mantenendo il ciclo di ripiegamento calnexina/calreticulina dipendente da UDP-glucosio, CD39L4 influenza la maturazione proteica nel RE, la N-glicosilazione e i programmi di proteostasi legati alla secrezione e alla maturazione dei recettori di membrana. L’attività di ENTPD5 si interseca con la segnalazione dello stress del RE e con la riprogrammazione metabolica attraverso effetti sulla domanda di ripiegamento proteico e sul traffico dipendente dai glicani. Un’espressione deregolata di ENTPD5 è stata associata a fenotipi di glicosilazione alterati e a vie legate alla proliferazione nella biologia dei tumori, rendendolo rilevante per studi sull’omeostasi del RE e sulle reti di segnalazione oncogeniche.

CD39L4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ENTPD5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD39L4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ENTPD5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ENTPD5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD39L4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ENTPD5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD39L4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD39L4 nelle cellule tumorali con espressione di ENTPD5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.