CBP20 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404124-ACT

NCBP2 umano codifica CBP20, la piccola subunità del complesso nucleare di legame al cappuccio (cap-binding complex), che riconosce il cap 7-metilguanosina sui trascritti nascenti di RNA polimerasi II. Attraverso l’associazione con CBP80 e l’interazione con fattori dello splicing, dell’esportazione dell’mRNA e della sorveglianza dell’RNA, CBP20 contribuisce a coordinare la maturazione del pre-mRNA, l’acquisizione della competenza all’esportazione nucleare e le vie di controllo qualità come la degradazione mediata da codoni di stop prematuri (nonsense-mediated decay). Il riconoscimento del cap dipendente da CBP20 influenza i programmi di espressione genica durante la progressione del ciclo cellulare e le risposte allo stress, modellando la maturazione e la stabilità dei trascritti. La disregolazione della maturazione e dell’esportazione dell’RNA dipendenti dal cap è frequentemente associata ad alterazioni della proliferazione e della manutenzione del genoma, rendendo NCBP2 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici del metabolismo dell’RNA in contesti patologici.

CBP20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NCBP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CBP20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NCBP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NCBP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CBP20. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NCBP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CBP20 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CBP20 nelle cellule tumorali con espressione di NCBP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.