Cbl-b Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400828-ACT

Il gene umano **CBLB** codifica **Cbl-b**, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING che attenua la segnalazione prossimale al recettore promuovendo l’ubiquitinazione e la degradazione (turnover) di intermedi chiave della trasduzione del segnale. Cbl-b contribuisce a definire le soglie di attivazione nelle cellule immunitarie, limitando le vie a valle del recettore dei linfociti T (TCR) e dei recettori co-stimolatori, e influenzando gli output di segnalazione **PI3K–AKT**, **MAPK** e **NF-κB**. Attraverso queste funzioni, concorre all’omeostasi e alla tolleranza immunitaria; la sua disregolazione è associata ad alterazioni delle risposte infiammatorie e a fenotipi di malattie immuno-mediate. Inoltre, la segnalazione dell’ubiquitina dipendente da Cbl-b può influire sul rimodellamento del citoscheletro e sul traffico recettoriale, aspetti rilevanti per la migrazione cellulare e gli stati di attivazione.

Cbl-b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CBLB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cbl-b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CBLB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CBLB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cbl-b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CBLB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cbl-b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cbl-b nelle cellule tumorali con espressione di CBLB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.