CASK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401742-ACT

CASK codifica uma proteína de ancoragem do tipo guanilato quinase associada à membrana (MAGUK) que organiza complexos multiproteicos nas sinapses e nas junções célula–célula, acoplando moléculas de adesão e canais iónicos a reguladores de sinalização e do citoesqueleto. Em neurónios humanos, a CASK participa no tráfego de vesículas sinápticas, na neurotransmissão e na regulação génica dependente da atividade, com funções associadas à sinalização por cálcio/calmodulina e a programas de polaridade juncional. Alterações na dosagem ou na função de CASK têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento, incluindo deficiência intelectual, epilepsia e microcefalia, sustentando a sua utilidade como um nó para estudar a montagem de sinapses e a maturação neuronal. Estes atributos tornam a CASK um alvo relevante para dissecar vias que governam a conectividade neuronal, a excitabilidade e redes de sinalização dependentes de proteínas de ancoragem.

CASK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CASK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CASK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CASK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CASK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CASK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CASK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CASK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CASK em células tumorais com expressão de CASK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.