C4a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402428-ACT

Il gene umano **C4A** codifica per il componente del complemento **C4**, un effettore centrale delle vie classica e della lectina del complemento, che potenzia la sorveglianza immunitaria tramite opsonizzazione e propagazione dei segnali infiammatori. La processazione proteolitica di C4 contribuisce alla generazione di frammenti di attivazione che coordinano le interazioni con i recettori del complemento e con altri mediatori dell’immunità innata, influenzando la rimozione dei complessi immuni e dei detriti cellulari. Variazioni nel dosaggio o nell’espressione di C4A sono state collegate a un’alterata attività del complemento e sono associate a disregolazione immunitaria, inclusa la suscettibilità a fenotipi autoimmuni e a processi neuroinfiammatori. In quanto nodo funzionale all’interno della cascata del complemento, C4A è ampiamente studiato in modelli di difesa dell’ospite, infiammazione tissutale e rimodellamento sinaptico o associato alla mielina.

C4a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C4A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C4a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C4A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C4A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C4a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C4A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C4a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C4a nelle cellule tumorali con espressione di C4A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.