C1orf68 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403506-ACT

C1orf68 umano (chromosome 1 open reading frame 68) codifica una proteina poco caratterizzata, con un’annotazione funzionale limitata e prove emergenti di un’espressione dipendente dal contesto tra tessuti e stati patologici. Sebbene i percorsi molecolari specifici debbano ancora essere chiariti completamente, studi a livello di trascritto suggeriscono che C1orf68 possa partecipare a programmi cellulari legati alla differenziazione, alle risposte allo stress e alla regolazione di reti di espressione genica. Pattern di espressione alterati sono stati riportati in molteplici dataset omici, supportandone l’impiego come gene candidato per studi meccanicistici della segnalazione e del controllo trascrizionale in modelli cellulari rilevanti per la malattia. Lo studio di C1orf68 può aiutare a chiarire come i geni “open reading frame” poco studiati contribuiscano al rimodellamento delle vie di segnalazione e alla variazione fenotipica.

C1orf68 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C1orf68 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C1orf68 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C1orf68 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C1orf68, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C1orf68. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C1orf68 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C1orf68 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C1orf68 nelle cellule tumorali con espressione di C1orf68 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.