C19orf66 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408037-ACT

C19orf66 codifica una proteina stimolata dall’interferone (nota anche come shiftless, SHFL) che limita la replicazione di diversi virus modulando la traduzione dell’RNA virale e alterando l’accumulo di proteine virali. Partecipa alla segnalazione dell’immunità innata a valle dell’interferone di tipo I e contribuisce a programmi effettori antivirali che rimodellano il metabolismo dell’RNA e la sintesi proteica nelle cellule infette. C19orf66 è stato associato a vie che controllano la stabilità dell’RNA e la regolazione della traduzione, e la sua attività si intreccia con le risposte cellulari allo stress che influenzano le interazioni ospite–patogeno. La disregolazione delle reti di geni stimolati dall’interferone, incluso C19orf66, è rilevante per studi su infiammazione cronica, suscettibilità virale e fenotipi di malattie associate al sistema immunitario.

C19orf66 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C19orf66 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C19orf66 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C19orf66 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C19orf66, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C19orf66. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C19orf66 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C19orf66 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C19orf66 nelle cellule tumorali con espressione di C19orf66 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.