BTLA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417186-ACT

BTLA (B and T lymphocyte associated) è un recettore immunoregolatorio della superfamiglia CD28 espresso in molteplici sottopopolazioni linfocitarie, in cui funge da checkpoint inibitorio per limitare la segnalazione del recettore dell’antigene e mantenere la tolleranza periferica. In seguito al legame con il suo ligando HVEM (TNFRSF14), BTLA recluta fosfatasi tramite i motivi citoplasmatici ITIM/ITSM per attenuare le cascate di chinasi prossimali, modulando l’attivazione delle cellule T, la produzione di citochine e l’omeostasi immunitaria. Questa via di segnalazione si interseca con reti coinibitorie più ampie che calibrano le risposte immunitarie adattative durante l’infiammazione e l’esposizione cronica agli antigeni. Un’alterata espressione o segnalazione di BTLA è stata associata a disregolazione immunitaria ed è stata studiata nel contesto di autoimmunità, infezioni e immunologia dei tumori.

BTLA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BTLA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BTLA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BTLA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BTLA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BTLA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BTLA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BTLA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BTLA nelle cellule tumorali con espressione di BTLA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.