BTBD14B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410250-ACT

NACC1 codifica un regolatore trascrizionale nucleare contenente un dominio BTB/POZ, implicato nel controllo dei programmi di espressione genica associati alla cromatina che influenzano proliferazione, differenziamento e risposte allo stress cellulare. Attraverso interazioni con complessi corepressori e con il macchinario trascrizionale, NACC1 è stato collegato a vie che regolano la progressione del ciclo cellulare, la transizione epitelio-mesenchimale e l’adattamento metabolico. Alterazioni dell’attività di NACC1 sono state riportate in molteplici contesti patologici, in particolare in oncologia, dove sono associate a cambiamenti della fitness delle cellule tumorali, a fenotipi legati all’invasività e a firme di risposta alle terapie. Queste caratteristiche rendono NACC1/BTBD14B un nodo utile per analizzare il rimodellamento delle reti trascrizionali e la regolazione degli stati di linea in sistemi modello umani.

BTBD14B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NACC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BTBD14B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NACC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NACC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BTBD14B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NACC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BTBD14B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BTBD14B nelle cellule tumorali con espressione di NACC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.