BRWD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415190-ACT

Il gene umano BRWD3 codifica una proteina associata alla cromatina contenente un bromodominio e ripetizioni WD, che partecipa alla regolazione epigenetica della trascrizione accoppiando il riconoscimento delle acetil-lisine al rimodellamento della cromatina e ai processi basati su stampo di DNA. Attraverso i suoi bromodomini e le ripetizioni WD con funzione di impalcatura, BRWD3 è implicata nel controllo di programmi di espressione genica che influenzano la proliferazione cellulare, la differenziazione e la stabilità del genoma. Studi genetici e funzionali hanno collegato la disregolazione di BRWD3 a fenotipi del neurosviluppo, inclusa la disabilità intellettiva legata al cromosoma X, e a perturbazioni trascrizionali più ampie rilevanti per la biologia dei tumori. BRWD3 rappresenta quindi un nodo utile per indagare il controllo delle vie dipendenti dalla cromatina e le relazioni genotipo-fenotipo nelle cellule umane.

BRWD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BRWD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BRWD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BRWD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BRWD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BRWD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BRWD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BRWD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BRWD3 nelle cellule tumorali con espressione di BRWD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.