BRDT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416531-ACT

BRDT (bromodomain testis-associated) è un lettore di cromatina della famiglia BET che riconosce le lisine acetilate sulle code istoniche per regolare programmi trascrizionali durante la spermatogenesi e la differenziazione delle cellule germinali. Modulando l’accessibilità della cromatina, BRDT influenza l’espressione genica dipendente dall’RNA polimerasi II, il rimodellamento della cromatina e il controllo epigenetico delle vie correlate alla meiosi. Una regolazione aberrante delle proteine BET, incluso BRDT, è stata associata ad alterati stati trascrizionali rilevanti per la biologia del cancro, in cui l’attività degli enhancer dipendente dai bromodomini e i programmi di linea cellulare possono andare incontro a deregolazione. In quanto fattore arricchito nel testicolo con interazioni mediate dai bromodomini ben definite, BRDT rappresenta un modello utile per studiare la regolazione trascrizionale dipendente dall’acetilazione e le dinamiche della cromatina.

BRDT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BRDT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BRDT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BRDT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BRDT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BRDT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BRDT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BRDT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BRDT nelle cellule tumorali con espressione di BRDT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.