Borealin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403003-ACT

CDCA8 codifica Borealin, una subunità essenziale del complesso dei passeggeri cromosomici (CPC) che coordina la progressione mitotica regolando l’allineamento dei cromosomi, gli attacchi cinetocoro–microtubulo, la segnalazione del checkpoint del fuso e la citochinesi. Attraverso l’accoppiamento funzionale con la chinasi Aurora B e con INCENP/Survivin, Borealin contribuisce a posizionare l’attività del CPC ai centromeri e nella regione del midzone per garantire una corretta segregazione dei cromatidi fratelli. L’alterazione dell’espressione di CDCA8 compromette la fedeltà mitotica, promuove l’aneuploidia ed è spesso associata a stati proliferativi osservati in molteplici contesti oncologici. Di conseguenza, CDCA8 è ampiamente studiato nelle vie che governano il controllo del ciclo cellulare, l’instabilità cromosomica e le risposte allo stress durante la divisione.

Borealin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDCA8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Borealin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDCA8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDCA8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Borealin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDCA8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Borealin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Borealin nelle cellule tumorali con espressione di CDCA8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.