BNIP-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419356-ACT

Il gene Bnip3 del topo codifica BNIP-3, un membro della famiglia BCL2 con solo dominio BH3 inducibile dall’ipossia, che si localizza principalmente sulla membrana mitocondriale esterna e regola l’omeostasi mitocondriale. BNIP-3 promuove la depolarizzazione mitocondriale, la mitofagia e la morte cellulare programmata attraverso vie legate alla segnalazione di HIF-1, al turnover autofagosoma–lisosoma e all’interazione con i regolatori dell’apoptosi. Nei tessuti sottoposti a stress metabolico, BNIP-3 contribuisce a modulare l’equilibrio tra sopravvivenza ed eliminazione dei mitocondri danneggiati, influenzando la produzione di specie reattive dell’ossigeno e l’adattamento bioenergetico. Un’attività deregolata di BNIP-3 è stata implicata in contesti di danno ischemico, neurodegenerazione e ipossia del microambiente tumorale, rendendola un nodo utile per studiare l’adattamento allo stress e il controllo qualità mitocondriale in modelli murini.

BNIP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Bnip3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BNIP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Bnip3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Bnip3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BNIP-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Bnip3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BNIP-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BNIP-3 nelle cellule tumorali con espressione di Bnip3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.