BAM32 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404873-ACT

DAPP1 (BAM32) è una proteina adattatrice particolarmente espressa nelle linee ematopoietiche, che collega la segnalazione dei fosfoinositidi alle vie effettrici a valle nelle cellule immunitarie. Legandosi al fosfatidilinositolo (3,4)-bisfosfato tramite il proprio dominio di omologia con la pleckstrina, BAM32 sostiene la propagazione del segnale dipendente da PI3K a partire da recettori quali il recettore delle cellule B e altri immunorecettori, influenzando il flusso di calcio, l’attività delle MAPK e il rimodellamento del citoscheletro. Queste funzioni collocano DAPP1 come regolatore dell’attivazione linfocitaria, delle risposte guidate dall’antigene e delle reti di segnalazione infiammatoria. Vie associate a BAM32 deregolate sono state implicate in un’anomala segnalazione delle cellule immunitarie e sono spesso oggetto di studio nelle ricerche sulla disfunzione immunitaria e sui meccanismi delle malattie ematologiche.

BAM32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DAPP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BAM32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DAPP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DAPP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BAM32. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DAPP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BAM32 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BAM32 nelle cellule tumorali con espressione di DAPP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.