Autotaxin Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-422180-LAC

Enpp2 codifica l’autotaxina, una lisofosfolipasi D secreta che converte la lisofosfatidilcolina in acido lisofosfatidico (LPA), un mediatore lipidico bioattivo che segnala attraverso i recettori per LPA per regolare la migrazione cellulare, il rimodellamento del citoscheletro, la proliferazione e la sopravvivenza. Nei tessuti murini, la segnalazione autotaxina–LPA contribuisce allo sviluppo vascolare e linfatico, al traffico delle cellule immunitarie e al rimodellamento della matrice extracellulare, integrandosi con cascate di segnalazione mediate da GPCR come RhoA/ROCK, PI3K–AKT e MAPK/ERK. Un’attività deregolata di ENPP2/autotaxina e un’aumentata produzione di LPA sono associate a processi infiammatori e fibrotici e sono state studiate nella biologia del microambiente tumorale, nell’angiogenesi e in fenotipi legati alla metastasi. Essendo un enzima solubile, l’autotaxina rappresenta inoltre un nodo sperimentalmente accessibile per interrogare le dinamiche della segnalazione lipidica nel mezzo condizionato e nello spazio extracellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale Autotaxin (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Enpp2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Autotaxin (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Enpp2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Autotaxin. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Enpp2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.