Autotaxin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401889-ACT

ENPP2 codifica per l’autotassina, una lisofosfolipasi D secreta che converte la lisofosfatidilcolina in acido lisofosfatidico (LPA), un potente mediatore lipidico che controlla la migrazione cellulare, la sopravvivenza, il rimodellamento del citoscheletro e la permeabilità vascolare. La segnalazione dell’LPA guidata dall’autotassina attiva vie dipendenti da GPCR, tra cui Rho/ROCK, PI3K–AKT e MAPK/ERK, collegando il metabolismo lipidico extracellulare a programmi trascrizionali e alla motilità. L’attività di ENPP2 è regolata in microambienti infiammatori e stromali e contribuisce a processi quali riparazione delle ferite, fibrosi e angiogenesi. La deregolazione dell’asse autotassina–LPA è implicata nell’invasione e metastatizzazione tumorale, nell’infiammazione cronica e nei meccanismi delle patologie fibrotiche, rendendo ENPP2 un bersaglio utile per lo studio delle vie di segnalazione in modelli cellulari umani.

Autotaxin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ENPP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Autotaxin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ENPP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ENPP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Autotaxin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ENPP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Autotaxin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Autotaxin nelle cellule tumorali con espressione di ENPP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.