ASF1A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404071-ACT

ASF1A codifica anti-silencing function 1A, uno chaperone istonico conservato per H3–H4 che coordina l’assemblaggio e il disassemblaggio dei nucleosomi durante la replicazione del DNA, la trascrizione e la riparazione dei danni al DNA. Interagendo con regolatori della cromatina quali CAF-1 e HIRA, ASF1A sostiene la riassemblaggio della cromatina accoppiato alla replicazione, le dinamiche di disponibilità degli istoni e il mantenimento degli stati epigenetici lungo il ciclo cellulare. Un’attività alterata di ASF1A può perturbare i programmi di stabilità del genoma e l’accessibilità della cromatina, collegando questo fattore alla proliferazione disregolata e alle risposte allo stress osservate nel cancro e in altre patologie con difetti di rimodellamento della cromatina. In quanto nodo centrale dell’omeostasi della cromatina, ASF1A è frequentemente studiata in vie che governano lo stress replicativo, la segnalazione dei checkpoint e la riprogrammazione trascrizionale.

ASF1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ASF1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASF1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ASF1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ASF1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASF1A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ASF1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASF1A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASF1A nelle cellule tumorali con espressione di ASF1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.