Arg Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417779-ACT

ABL2 codifica Arg, una tirosin-chinasi non recettoriale della famiglia Abl che integra segnali provenienti dai recettori per i fattori di crescita e dai complessi di adesione per regolare il rimodellamento del citoscheletro di actina, la migrazione cellulare e la crescita dei neuriti. Arg partecipa al controllo, dipendente dalla fosforilazione, della dinamica delle adesioni focali e di vie collegate alle GTPasi Rho che modellano morfologia e motilità cellulare. Grazie ai suoi ruoli nell’organizzazione del citoscheletro e nella trasduzione del segnale, l’attività o l’espressione deregolata di ABL2 è studiata in contesti che includono la segnalazione oncogenica, fenotipi associati all’invasività e l’attivazione aberrante di reti di chinasi. Arg umano rappresenta quindi un nodo utile per studi meccanicistici sul crosstalk tra vie guidate da chinasi e sui comportamenti cellulari dipendenti dal citoscheletro.

Arg Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Arg Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Arg. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Arg nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Arg nelle cellule tumorali con espressione di ABL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.