ARFGAP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403939-ACT

ARFGAP1 codifica per la proteina 1 attivatrice della GTPasi del fattore di ADP-ribosilazione, un regolatore chiave del ciclo di ARF1 che promuove l’idrolisi del GTP per coordinare la gemmazione e la rimozione del rivestimento delle vescicole nella via secretoria precoce. Modulando il trasporto rivestito da COPI, il traffico Golgi–RE e la dinamica della curvatura di membrana, ARFGAP1 contribuisce a mantenere la struttura del Golgi e un efficiente smistamento del carico. La sua attività si intreccia con la segnalazione delle piccole GTPasi e con reti più ampie di traffico di membrana che influenzano il riciclo dei recettori e l’output della segnalazione intracellulare. La disregolazione del traffico dipendente da ARF e dell’omeostasi del Golgi è stata implicata in fenotipi rilevanti per la segnalazione oncogenica, la neurodegenerazione e lo sfruttamento da parte dei patogeni delle macchine di trasporto dell’ospite, rendendo ARFGAP1 un nodo utile per studi meccanicistici.

ARFGAP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARFGAP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARFGAP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARFGAP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARFGAP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARFGAP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARFGAP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARFGAP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARFGAP1 nelle cellule tumorali con espressione di ARFGAP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.