ARAP3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405365-ACT

ARAP3 (noto anche come CENTD3) codifica una proteina ArfGAP e RhoGAP legante i fosfoinositidi che collega la segnalazione di PI3K alla regolazione coordinata delle GTPasi ARF6 e della famiglia Rho. Grazie alla sua architettura multidominio, ARAP3 modula il rimodellamento del citoscheletro di actina, il traffico di membrana, l’adesione dipendente dalle integrine e le risposte chemiotattiche, in particolare nelle linee cellulari endoteliali ed ematopoietiche. L’attività di ARAP3 si integra con vie che controllano la migrazione cellulare, la morfogenesi vascolare e la segnalazione infiammatoria, rendendola rilevante per studi su angiogenesi e traffico leucocitario. Una segnalazione delle piccole GTPasi deregolata e un’alterata espressione di ARAP3 sono state associate all’invasione delle cellule tumorali e al rimodellamento del microambiente tumorale, supportandone l’uso come nodo per l’interrogazione meccanicistica delle vie di segnalazione.

ARAP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARAP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARAP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARAP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARAP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARAP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARAP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARAP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARAP3 nelle cellule tumorali con espressione di ARAP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.