AMIGO2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403312-ACT

AMIGO2 (molecola di adesione con dominio tipo Ig 2) è una proteina transmembrana di tipo I espressa sulla superficie cellulare, appartenente alla famiglia AMIGO, che supporta le interazioni cellula–cellula, la crescita dei neuriti e la guida assonale durante lo sviluppo del sistema nervoso. Nelle cellule umane, AMIGO2 è stata associata alla regolazione di programmi di segnalazione dipendenti dall’adesione, della migrazione e della sopravvivenza, in intersezione con il rimodellamento del citoscheletro e con vie mediate da recettori. Un’alterata espressione di AMIGO2 è stata riportata in contesti di progressione tumorale e di fenotipi associati alla metastatizzazione, in cui cambiamenti nell’adesione e nella motilità possono rimodellare l’architettura tissutale. Queste caratteristiche rendono AMIGO2 un bersaglio utile per studiare come i segnali extracellulari vengano accoppiati alla segnalazione intracellulare e agli stati di differenziamento.

AMIGO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AMIGO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AMIGO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AMIGO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AMIGO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AMIGO2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AMIGO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AMIGO2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AMIGO2 nelle cellule tumorali con espressione di AMIGO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.