alpha Synuclein Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423051-ACT

Il gene Snca del topo codifica l’alfa-sinucleina, una proteina neuronale presinaptica che regola il traffico delle vescicole sinaptiche, l’assemblaggio del complesso SNARE e le dinamiche di rilascio dei neurotrasmettitori. Attraverso interazioni con le membrane lipidiche e con proteine associate alle vescicole, l’alfa-sinucleina influenza vie di proteostasi, tra cui l’attività del sistema ubiquitina–proteasoma e la funzione dell’asse autofagia–lisosoma, e può incidere sull’omeostasi mitocondriale in condizioni di stress cellulare. Alterazioni dei livelli, il misfolding e l’aggregazione dell’alfa-sinucleina sono associati a neurodegenerazione e neuroinfiammazione, rendendo Snca un bersaglio chiave per studi meccanicistici sulla segnalazione neuronale e sul controllo qualità delle proteine. Le variazioni di espressione di Snca vengono inoltre utilizzate per interrogare le vie che regolano il riciclo delle vescicole, le risposte allo stress ossidativo e l’aggregazione proteica intracellulare.

alpha Synuclein Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Snca senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

alpha Synuclein Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Snca nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Snca, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di alpha Synuclein. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Snca nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da alpha Synuclein nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via alpha Synuclein nelle cellule tumorali con espressione di Snca silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.