Akt3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400028-ACT

AKT3 codifica la chinasi serina/treonina Akt3, un effettore dipendente da PI3K che integra segnali provenienti da fattori di crescita e nutrienti per regolare la sopravvivenza cellulare, il metabolismo, la proliferazione e la differenziazione. Akt3 partecipa alla segnalazione canonica PI3K–AKT–mTOR e interseca reti mediate da FOXO, GSK3 e BAD che modulano la resistenza all’apoptosi, la sintesi proteica e la progressione del ciclo cellulare. Nei tessuti umani, l’attività di AKT3 è particolarmente rilevante per lo sviluppo neurale e per le risposte allo stress cellulare, e una segnalazione deregolata è stata associata ad alterazioni del controllo della crescita e al rimodellamento di vie oncogeniche in molteplici contesti patologici. Modulando l’espressione di AKT3 è quindi possibile analizzare le dinamiche di via, la regolazione tramite feedback e le transizioni di stato cellulare legate a fenotipi proliferativi e metabolici.

Akt3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Akt3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Akt3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Akt3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Akt3 nelle cellule tumorali con espressione di AKT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.