AKR1C14 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430591-ACT

Akr1c14 codifica AKR1C14, una aldo-cheto reduttasi murina che catalizza la riduzione NADPH-dipendente di substrati contenenti gruppi carbonilici, inclusi steroidi endogeni e aldeidi lipidiche. Modulando la disponibilità locale degli ormoni steroidei e detossificando specie carboniliche reattive, AKR1C14 contribuisce all’omeostasi redox e alla segnalazione metabolica in tessuti come il fegato e gli organi riproduttivi. Questa attività enzimatica si interseca con vie legate al metabolismo degli xenobiotici, alle risposte allo stress ossidativo e alla regolazione della segnalazione dei recettori nucleari. Un’attività alterata delle aldo-cheto reduttasi è spesso studiata nel contesto di disfunzioni metaboliche, infiammazione e fisiologia ormone-dipendente, rendendo Akr1c14 un nodo utile per indagini meccanicistiche nei modelli murini.

AKR1C14 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Akr1c14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AKR1C14 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Akr1c14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Akr1c14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AKR1C14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Akr1c14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AKR1C14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AKR1C14 nelle cellule tumorali con espressione di Akr1c14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.