AID Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401542-ACT

AICDA umano codifica la deaminasi delle citidine indotta dall’attivazione (AID), un enzima di editing del DNA/RNA che catalizza la deaminazione da citidina a uridina sul DNA a singolo filamento durante la trascrizione. AID è essenziale per la diversificazione degli anticorpi attraverso l’ipermutazione somatica e la ricombinazione di cambio di classe nelle cellule B dei centri germinativi, collegando la sua attività a processi di riparazione del DNA, tra cui la riparazione per escissione di basi e la riparazione dei mismatch. Una regolazione rigorosa di AID è necessaria per limitare la mutagenesi fuori bersaglio, poiché un’espressione deregolata o ectopica può aumentare l’instabilità genomica e contribuire a traslocazioni cromosomiche e all’accumulo di mutazioni. Di conseguenza, AICDA è ampiamente studiato nelle vie che governano l’immunità adattativa, la differenziazione delle cellule B e i meccanismi di trasformazione oncogena guidata da mutazioni.

AID Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AICDA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AID Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AICDA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AICDA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AID. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AICDA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AID nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AID nelle cellule tumorali con espressione di AICDA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.