AGAP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409504-ACT

AGAP1 (ArfGAP con dominio GTPasi, ripetizioni ankyrin e dominio PH 1) è una proteina attivatrice della GTPasi ARF che coordina il traffico di membrana e la dinamica del citoscheletro regolando la formazione di vescicole dipendente da ARF e il trasporto endosomiale. Attraverso i suoi domini PH e a ripetizioni ankyrin, AGAP1 collega la segnalazione dei fosfoinositidi allo smistamento mediato da adattatori, influenzando il riciclo dei recettori, la crescita dei neuriti e il rimodellamento dell’actina. Alterazioni dell’espressione o della funzione di AGAP1 sono state associate a una disregolazione delle vie endocitiche e dei processi sinaptici, rendendola rilevante per studi su fenotipi di neuro-sviluppo e sull’omeostasi cellulare. I suoi ruoli negli endosomi e alla membrana plasmatica si intrecciano inoltre con reti di segnalazione che dipendono dalla disponibilità dei recettori e da pool di fosfoinositidi spazialmente ristretti.

AGAP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AGAP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AGAP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AGAP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AGAP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AGAP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AGAP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AGAP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AGAP1 nelle cellule tumorali con espressione di AGAP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.