ADM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402779-ACT

Il gene ADM umano codifica l’adrenomedullina, un ormone peptidico secreto ampiamente espresso nei tessuti vascolari ed epiteliali, che regola la vasodilatazione, l’integrità della barriera endoteliale e l’omeostasi dei fluidi. Attraverso la segnalazione mediata dal recettore simile al recettore della calcitonina (CALCRL) accoppiato a RAMP2 o RAMP3, ADM attiva la via cAMP/PKA e, a valle, le vie MAPK e PI3K–AKT per modulare l’angiogenesi, la sopravvivenza cellulare e le risposte infiammatorie. ADM risponde all’ipossia e allo stress cellulare e contribuisce a programmi adattativi che modellano il rimodellamento vascolare e la perfusione tissutale. Un’espressione deregolata di ADM è stata collegata a disfunzione cardiovascolare, perdita di tenuta vascolare associata alla sepsi e angiogenesi associata ai tumori, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici sulla biologia endoteliale e sulla segnalazione del microambiente.

ADM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADM nelle cellule tumorali con espressione di ADM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.