ADH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402260-ACT

L’ADH1A umano codifica l’alcol deidrogenasi 1A (ADH1), un’ossidoreduttasi citosolica zinco-dipendente che catalizza l’ossidazione dell’etanolo e di altri alcoli a catena corta nei corrispondenti aldeidi, in modo dipendente da NAD⁺. Questa attività enzimatica contribuisce al metabolismo degli xenobiotici e all’omeostasi dei retinoidi influenzando l’interconversione tra intermedi alcolici e aldeidici, che si interseca con le reazioni delle aldeide deidrogenasi. L’espressione di ADH1A è più marcata soprattutto nel fegato e nel tratto gastrointestinale, dove modula l’equilibrio redox cellulare (NADH/NAD⁺) e incide sui flussi metabolici a valle lungo vie collegate alle aldeidi e all’acetil-CoA. Un’alterata regolazione o varianti genetiche nei geni del metabolismo di alcoli/aldeidi, inclusi i membri della famiglia ADH, sono associate a differenze nella suscettibilità al danno tissutale correlato all’alcol e nelle risposte all’esposizione a cancerogeni, rendendo ADH1A un nodo utile per studi sui meccanismi di malattia incentrati sul metabolismo.

ADH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADH1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADH1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADH1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADH1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADH1 nelle cellule tumorali con espressione di ADH1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.