ADAMTS-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403133-ACT

ADAMTS4 codifica per ADAMTS-4 (aggrecanasi-1), una metalloproteinasi secreta dipendente dallo zinco che scinde i proteoglicani della matrice extracellulare, come aggrecan e versican, regolando così il turnover della matrice e il rimodellamento tissutale. La sua attività si interseca con la segnalazione infiammatoria e con vie della matrice extracellulare che influenzano l’omeostasi dei condrociti, l’integrità della cartilagine e le interazioni tra cellule stromali e matrice. Un’espressione o un’attività proteolitica di ADAMTS-4 deregolate sono state associate a processi di degradazione della cartilagine e a patologie più ampie del tessuto connettivo, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico in studi sul sistema muscoloscheletrico e sul microambiente infiammatorio. ADAMTS-4 è anche studiata come modulatore della migrazione cellulare e della segnalazione guidata dalla matrice attraverso variazioni nella composizione dei proteoglicani.

ADAMTS-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADAMTS4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADAMTS-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADAMTS4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADAMTS4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADAMTS-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADAMTS4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADAMTS-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADAMTS-4 nelle cellule tumorali con espressione di ADAMTS4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.