Plásmido CRISPR de Activación (h) A20/TNFAIP3: sc-400447-ACT

TNFAIP3 codifica A20, una enzima editora de ubiquitina con dedos de zinc que actúa como regulador negativo central de la señalización inflamatoria. A20 pone fin a la activación de las vías NF-κB y MAPK aguas abajo de receptores como TNFR, IL-1R y los TLR, modulando las cadenas de ubiquitina en intermediarios clave de señalización, lo que limita la producción de citocinas y evita una activación inmunitaria prolongada. Mediante el control de la muerte celular y de las respuestas al estrés, A20 ayuda a mantener la homeostasis inmunitaria en muchos tipos celulares, incluidas las líneas mieloides y linfoides. La desregulación de la expresión o la función de TNFAIP3 se ha vinculado a patología inmunomediada y a mecanismos de enfermedad inflamatoria, por lo que es un objetivo ampliamente utilizado para estudiar la retroalimentación de la señalización, la biología de la ubiquitina y la interacción entre la inmunidad innata y adaptativa.

A20/TNFAIP3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TNFAIP3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

A20/TNFAIP3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TNFAIP3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TNFAIP3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de A20/TNFAIP3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TNFAIP3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de A20/TNFAIP3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía A20/TNFAIP3 en células tumorales con expresión de TNFAIP3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.