A20/TNFAIP3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400447-ACT

TNFAIP3 codifica A20, un enzima di editing dell’ubiquitina con dita di zinco che agisce come regolatore negativo centrale della segnalazione infiammatoria. A20 interrompe l’attivazione delle vie NF-κB e MAPK a valle di recettori quali TNFR, IL-1R e TLR, modulando le catene di ubiquitina su intermedi chiave della segnalazione e limitando così la produzione di citochine e prevenendo un’attivazione immunitaria prolungata. Attraverso il controllo della morte cellulare e delle risposte allo stress, A20 contribuisce a mantenere l’omeostasi immunitaria in molti tipi cellulari, incluse le linee mieloidi e linfoidi. Un’espressione o una funzione disregolata di TNFAIP3 è stata associata a patologie immuno-mediate e a meccanismi di malattia infiammatoria, rendendolo un bersaglio ampiamente utilizzato per studiare i feedback della segnalazione, la biologia dell’ubiquitina e il crosstalk tra immunità innata e adattativa.

A20/TNFAIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNFAIP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

A20/TNFAIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNFAIP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNFAIP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di A20/TNFAIP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNFAIP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da A20/TNFAIP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via A20/TNFAIP3 nelle cellule tumorali con espressione di TNFAIP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.