4E-BP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400398-ACT

EIF4EBP1 codifica 4E-BP1, un repressore sensibile alla fosforilazione della traduzione cap-dipendente che si lega a EIF4E e limita l’assemblaggio del complesso eIF4F. In quanto principale effettore a valle della via di segnalazione PI3K–AKT–mTOR, 4E-BP1 integra segnali provenienti da fattori di crescita, nutrienti e stress per modulare la sintesi proteica globale, la crescita cellulare e l’adattamento metabolico. La fosforilazione di 4E-BP1 mediata da mTORC1 libera EIF4E, promuovendo la traduzione di trascritti coinvolti in proliferazione e sopravvivenza, collegando così la regolazione di EIF4EBP1 alla proteostasi e al controllo del ciclo cellulare. L’attività di 4E-BP1 e il suo stato di fosforilazione alterati sono spesso oggetto di studio in oncologia, nella segnalazione metabolica e nelle risposte allo stress, contesti in cui la riprogrammazione della traduzione contribuisce a fenotipi associati alla malattia.

4E-BP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF4EBP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

4E-BP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF4EBP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF4EBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 4E-BP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF4EBP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 4E-BP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 4E-BP1 nelle cellule tumorali con espressione di EIF4EBP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.