β-NAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411126-ACT

L’AP3B2 umano codifica β-NAP, la subunità beta neuronale arricchita del complesso proteico adattatore 3 (AP-3), che media la selezione del carico e il traffico dal network trans-Golgi e dai compartimenti endosomiali verso i lisosomi e organelli correlati. β-NAP sostiene la formazione e il targeting di vescicole critiche per la biogenesi delle vescicole sinaptiche e la secrezione regolata, collegando AP3B2 allo smistamento endolisosomiale, alla localizzazione delle proteine di membrana e all’omeostasi neuronale. L’alterazione del traffico dipendente da AP-3 può modificare il rilascio di neurotrasmettitori e la maturazione degli organelli, rendendo AP3B2 un nodo rilevante per lo studio dei meccanismi associati al neurosviluppo e alla neurodegenerazione. L’espressione e la funzione di AP3B2 sono quindi ampiamente utilizzate come readout in vie che coinvolgono il trasporto vescicolare, la funzione sinaptica e la dinamica endosoma–lisosoma.

β-NAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AP3B2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β-NAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AP3B2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AP3B2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β-NAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AP3B2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β-NAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β-NAP nelle cellule tumorali con espressione di AP3B2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.