α-SNAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403996-ACT

NAPA codifica per l’α-SNAP umano, una proteina solubile di attacco a NSF (soluble NSF attachment protein) che si lega ai complessi SNARE e coopera con NSF per promuovere, in modo ATP-dipendente, lo smontaggio degli SNARE, consentendo cicli ripetuti di docking delle vescicole e fusione di membrana. Tramite questa funzione di tipo chaperone, α-SNAP supporta l’esocitosi costitutiva e regolata, l’endocitosi e il traffico Golgi-RE, influenzando quindi la secrezione, il riciclo dei recettori e l’omeostasi degli organelli. La perturbazione del ciclo SNARE dipendente da NAPA può compromettere la proteostasi e la dinamica di membrana, processi che intersecano la funzione sinaptica e le risposte allo stress. Un traffico vescicolare deregolato e un turnover anomalo dei complessi SNARE sono implicati nei meccanismi di malattie neurodegenerative e del neurosviluppo, rendendo α-SNAP un nodo utile per studi “pathway-focused” sul trasporto intracellulare.

α-SNAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NAPA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α-SNAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NAPA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NAPA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α-SNAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NAPA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α-SNAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α-SNAP nelle cellule tumorali con espressione di NAPA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.