α-parvin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405769-ACT

PARVA codifica l’α-parvina, un adattatore delle adesioni focali che collega la segnalazione delle integrine al citoscheletro di actina attraverso interazioni con l’integrin-linked kinase (ILK) e le proteine PINCH. Organizzando il complesso ILK–PINCH–parvin, l’α-parvina contribuisce a coordinare adesione, espansione (spreading) e migrazione cellulare, influenzando la meccanotrasduzione e le vie di rimodellamento del citoscheletro. L’attività di PARVA è quindi rilevante per processi quali il rilevamento della matrice extracellulare, la dinamica dei lamellipodi e la segnalazione a supporto della sopravvivenza cellulare. Una segnalazione delle adesioni focali deregolata che coinvolge PARVA è stata associata ad alterazioni dell’architettura tissutale e a comportamenti cellulari invasivi, rendendolo un nodo utile per studiare fenotipi dipendenti dall’adesione in modelli rilevanti per la malattia.

α-parvin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARVA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α-parvin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARVA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARVA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α-parvin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARVA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α-parvin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α-parvin nelle cellule tumorali con espressione di PARVA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.