α-internexin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402920-ACT

INA codifica per l’α-internexina, una proteina dei filamenti intermedi di tipo IV arricchita nei neuroni, che si integra nella rete dei neurofilamenti per sostenere il calibro assonale, la stabilità del citoscheletro e la crescita dei neuriti. L’α-internexina partecipa alla dinamica di assemblaggio dei filamenti intermedi e si coordina con altri componenti del citoscheletro neuronale durante la differenziazione e la maturazione sinaptica. Un’espressione alterata o l’aggregazione dei filamenti intermedi neuronali è associata a meccanismi rilevanti per la neurodegenerazione e le lesioni del sistema nervoso, inclusi il trasporto assonale compromesso e lo stress della proteostasi. Come marcatore associato alla linea cellulare, INA viene inoltre impiegato per studiare l’identità neuronale e i programmi di differenziazione in modelli neurali dello sviluppo e derivati da cellule staminali.

α-internexin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α-internexin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α-internexin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α-internexin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α-internexin nelle cellule tumorali con espressione di INA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.