α1a Tubulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400022-ACT

TUBA1A codifica per la tubulina umana α1a, un componente fondamentale degli eterodimeri α/β-tubulina che polimerizzano in microtubuli, a sostegno dell’architettura del citoscheletro, del trasporto intracellulare e della formazione del fuso mitotico. La dinamica dei microtubuli guidata dalla tubulina α1a contribuisce alla polarità cellulare, alla crescita assonale e alla migrazione neuronale, integrandosi con vie che controllano il rimodellamento del citoscheletro, la progressione del ciclo cellulare e il traffico mediato da proteine motrici. Una funzione deregolata di TUBA1A è associata a fenotipi di neurosviluppo legati a un’assemblaggio inefficiente dei microtubuli e a un’alterata connettività neuronale, rendendolo un marcatore utile per studiare l’integrità del citoscheletro nei sistemi neurali. In quanto proteina strutturale ampiamente espressa, la tubulina α1a è spesso impiegata in saggi che valutano la stabilità dei microtubuli, il posizionamento degli organelli e i cambiamenti del citoscheletro associati alla differenziazione.

α1a Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TUBA1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α1a Tubulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TUBA1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TUBA1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α1a Tubulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TUBA1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α1a Tubulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α1a Tubulin nelle cellule tumorali con espressione di TUBA1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.