Wip1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400980-ACT

PPM1D codifica Wip1 (PPM1D), una fosfatasi serina/treonina Mg2+/Mn2+-dipendente indotta da p53 che funge da principale regolatore a feedback negativo della risposta al danno al DNA. Wip1 defosforila numerose proteine coinvolte nei checkpoint e nella segnalazione dello stress, tra cui p53, componenti delle vie ATM/ATR e nodi di segnalazione della p38 MAPK, modulando così il recupero dei checkpoint del ciclo cellulare, la stabilità del genoma e le soglie di apoptosi. Attraverso la modulazione di queste vie, Wip1 influenza le risposte allo stress genotossico e allo stress da replicazione; alterazioni dell’attività e del numero di copie di PPM1D sono state riportate in diversi contesti tumorali. La perturbazione sperimentale di Wip1 è ampiamente utilizzata per analizzare le dinamiche dei checkpoint, la segnalazione adattativa allo stress e il crosstalk tra vie che controllano proliferazione e senescenza.

Wip1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPM1D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wip1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPM1D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPM1D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wip1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPM1D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wip1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wip1 nelle cellule tumorali con espressione di PPM1D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.