Wee 1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-423702-LAC

Wee1 murina (Wee1) è una chinasi serina/treonina conservata che limita l’attività di CDK1 tramite fosforilazione inibitoria, imponendo il checkpoint G2/M e coordinando l’ingresso in mitosi con il completamento della replicazione e della riparazione del DNA. Integrando i segnali della risposta al danno al DNA, Wee1 contribuisce a mantenere la stabilità delle forcelle di replicazione e l’integrità del genoma durante le fasi S e G2, influenzando la tempistica del ciclo cellulare, la dinamica della cromatina e le decisioni sul destino cellulare. Una segnalazione di Wee1 deregolata è associata a un controllo proliferativo alterato e all’adattamento del checkpoint osservati in modelli di instabilità genomica e biologia del cancro, ed è spesso studiata in contesti in cui lo stress replicativo e la competenza dei checkpoint determinano i fenotipi cellulari.

Le particelle di attivazione lentivirale Wee 1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Wee1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Wee 1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Wee1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Wee 1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Wee1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.