Visual Arrestin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402997-ACT

SAG codifica l’arrestina visiva (arrestina-1), una proteina regolatoria специфica dei fotorecettori che termina la segnalazione della rodopsina legandosi alla rodopsina fosforilata e attivata dalla luce e modulando la fototrasduzione a valle mediata dalla transducina. Questo passaggio di desensibilizzazione è essenziale per la cinetica di recupero, la fedeltà del segnale e la protezione delle cellule dei bastoncelli da un’eccessiva attivazione della via GPCR. L’arrestina visiva contribuisce inoltre al traffico recettoriale e al bilanciamento della segnalazione nel segmento esterno, integrandosi con i cicli di fosforilazione della rodopsina guidati da GRK1. La disregolazione o varianti patogenetiche in SAG sono associate a disfunzioni retiniche ereditarie, rendendolo un bersaglio chiave per studi meccanicistici sullo stress dei fotorecettori, sui percorsi di degenerazione e sulla trasduzione del segnale visivo.

Visual Arrestin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SAG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Visual Arrestin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SAG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SAG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Visual Arrestin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SAG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Visual Arrestin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Visual Arrestin nelle cellule tumorali con espressione di SAG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.