VE-cadherin-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401695-ACT

PCDH12 codifica la VE-caderina-2, una protocaderina calcio-dipendente arricchita nelle giunzioni cellula-cellula dell’endotelio, dove sostiene l’adesione, l’integrità della barriera e una morfogenesi vascolare coordinata. Attraverso interazioni omofiliche e l’accoppiamento con adattatori del citoscheletro e della segnalazione, la VE-caderina-2 influenza il rimodellamento delle giunzioni, la polarità cellulare e i programmi di migrazione che si intrecciano con le reti di segnalazione angiogeniche e infiammatorie. Una disregolazione dell’adesione endoteliale e della permeabilità legata ad alterazioni dell’attività di PCDH12 è stata associata a fenotipi di disfunzione vascolare e a disturbi dello sviluppo neurovascolare, rendendola rilevante per studi sulla stabilità dei vasi e sulla perfusione tissutale. Poiché le caderine giunzionali modulano anche la transmigrazione dei leucociti e le risposte allo stress da flusso (shear stress), PCDH12 viene spesso analizzato in modelli di attivazione endoteliale e di patologia microvascolare.

VE-cadherin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCDH12 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VE-cadherin-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCDH12 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCDH12, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VE-cadherin-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCDH12 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VE-cadherin-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VE-cadherin-2 nelle cellule tumorali con espressione di PCDH12 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.