USP54 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405800-ACT

USP54 umano codifica una deubiquitinasi della famiglia delle proteasi specifiche per l’ubiquitina, che si prevede regoli il turnover proteico e l’ampiezza della segnalazione invertendo la coniugazione dell’ubiquitina. Attraverso la deubiquitinazione, USP54 può influenzare la proteostasi, il traffico endosomiale e la dinamica delle vie trascrizionali e di risposta allo stress che dipendono da rimodellamenti ubiquitina-dipendenti. La disregolazione della segnalazione mediata dall’ubiquitina è ampiamente implicata nella trasformazione oncogenica, nella neurobiologia e nella modulazione immunitaria, rendendo USP54 un bersaglio rilevante per analizzare il comportamento delle reti controllate dall’ubiquitina. Lo studio dell’espressione e della funzione di USP54 può chiarire come l’attività delle deubiquitinasi plasmi il crosstalk tra vie di segnalazione e i fenotipi cellulari in sistemi modello rilevanti per la malattia.

USP54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP54 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP54 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP54 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP54, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP54. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP54 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP54 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP54 nelle cellule tumorali con espressione di USP54 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.