USP45 Particelle di Attivazione Lentivirale (m2): sc-429548-LAC-2

Il gene murino Usp45 codifica l’enzima deubiquitinante USP45, una proteasi specifica per l’ubiquitina che regola il turnover proteico rimuovendo catene di ubiquitina e modulando così la stabilità e l’attività di importanti substrati nucleari. USP45 è stato implicato nel mantenimento del genoma grazie a ruoli nella riparazione del DNA e nelle risposte allo stress associato alla replicazione, collegandolo a vie che preservano l’integrità della cromatina e coordinano la progressione del ciclo cellulare. La deubiquitinazione disregolata e la compromessa gestione del danno al DNA associate ad alterazioni di USP45 sono rilevanti per studi sui fenotipi di instabilità genomica e sui meccanismi correlati al cancro. Gli strumenti di ricerca per Usp45/USP45 supportano indagini sulla segnalazione dell’ubiquitina, sulla mappatura delle reti di risposta al danno al DNA e sulla genomica funzionale in modelli murini cellulari e in vivo.

Le particelle di attivazione lentivirale USP45 (m2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Usp45 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale USP45 (m2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Usp45, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di USP45. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Usp45 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.