USP43 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416563-ACT

L’USP43 umano codifica un enzima deubiquitinante del sistema ubiquitina–proteasoma che catalizza la rimozione dell’ubiquitina dai substrati proteici, modulandone stabilità, localizzazione e segnali a valle. Regolando finemente il turnover proteico dipendente dall’ubiquitina, USP43 può influenzare processi fondamentali quali la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e la regolazione dell’espressione genica associata alla cromatina. La disregolazione delle vie di deubiquitinazione è spesso collegata a instabilità genomica e a fenotipi di proliferazione aberrante, rendendo USP43 un nodo rilevante per studi meccanicistici in modelli cellulari associati a patologie. La profilazione della segnalazione dell’ubiquitina dipendente da USP43 può aiutare a chiarire come le reti di proteostasi si interfaccino con le risposte allo stress e con programmi trascrizionali specifici di linea cellulare.

USP43 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP43 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP43 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP43 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP43, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP43. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP43 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP43 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP43 nelle cellule tumorali con espressione di USP43 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.